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(2003/(2003/(2003/(2003/10/1510/1510/1510/15----2003/11/052003/11/052003/11/052003/11/05))))
教授教授教授教授::::欧柏荣欧柏荣欧柏荣欧柏荣










试验试验试验试验1. Dephosphorylation of linearized plasmid DNA1. Dephosphorylation of linearized plasmid DNA1. Dephosphorylation of linearized plasmid DNA1. Dephosphorylation of linearized plasmid DNA
原理原理原理原理::::当plasmid被酵素限制酶切割过后,因其切位原本就是互补的,很容易就
会再自接,所以将5'端之磷酸切除可避免此情形发生频率偏高.
过程过程过程过程::::将线性的plasmid加入CIAP (cattle intestinal alkaline phosphatase),将两端的
磷酸根切除,利用盐类(3M NaOAc)与不同浓度之酒精把DNA沉淀回收.
结果结果结果结果::::在试验4同时观察.


试验试验试验试验2. 2. 2. 2. Extraction of DNA with phenolExtraction of DNA with phenolExtraction of DNA with phenolExtraction of DNA with phenol::::chloroformchloroformchloroformchloroform
原理原理原理原理::::在去磷酸化过程中,仍残留许多的蛋白质及盐类(CIAP and CIAP buffer),
为了帮助后续实验的进行,因此利用phenol(将protein变性),chloroform(将
phenol带离水层)将DNA纯化,萃取出来.
过程过程过程过程::::加入等量phenol: chloroform,充分混合后离心取上层液,回收DNA.
结果结果结果结果::::在试验4同时观察.


试验试验试验试验3. 3. 3. 3. Precipitation of DNA with ethanolPrecipitation of DNA with ethanolPrecipitation of DNA with ethanolPrecipitation of DNA with ethanol
原理原理原理原理::::DNA为一带负电之物质,加入正电离子与DNA结合后,利用离心将DNA
带出来.
过程过程过程过程::::将已经过phenol: chloroform纯化之DNA,加入3M NaOAc(提供正电),在
低温结合后,经高速离心将DNA沉降下来,最后再加入70%酒精把正电
离子洗掉.
结果结果结果结果::::在试验4同时观察.


试验试验试验试验4444. . . . Ligation by T4 DNA ligaseLigation by T4 DNA ligaseLigation by T4 DNA ligaseLigation by T4 DNA ligase
原理原理原理原理::::利用病毒的特殊酵素(T4 DNA ligase)将不同片段的DNA接合在一起.
过程过程过程过程::::用T4 DNA ligase将(试验1.2.3.)纯化过的plasmid,GFP基因与10倍buffer
混合,经4℃ overnight.其特殊之处为buffer中有提供能量之ATP,最好
先分装避免使用时常解冻而失效.
有二组
control A:4μl plasmid + 1μl ligase + 1μl 10*buffer + 4μl ddH2O
exp. B:4μl plasmid + 1μl ligase + 1μl 10*buffer + 4μl GFP fragment
结果结果结果结果::::本组为第十组,所loading之位置在lane 14与1
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