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丛枝菌根真菌对黄瓜枯萎病生物防治效果及对次生代谢物...  文件类型:DOC/Microsoft Word  文件大小:字节
丛枝菌根真菌对黄瓜枯萎病生物防治效果及对次生代谢物的影响
摘要
温室条件下,通过盆栽试验研究接种不同丛枝菌根真菌(Glomus.etunicatum与 Glomus.clarum)对黄瓜枯萎病的生物防治效果和对次生代谢产物的影响.利用设施园艺黄瓜生产中育苗移栽这一常用技术,在育苗时接种菌根真菌,幼苗生长28天后,采用灌根法接种黄瓜枯萎病病原菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.)以模拟在保护地黄瓜生产中枯萎病危害.分别在接种病原菌之前和接种病原菌之后14 天收获植株样品,统计植株的发病率和病情指数,测定植株生长指标和其体内此生代谢物指标.
试验结果表明,育苗时接种AM真菌能够降低植株枯萎病发病率和病情指数,相对防治效果达66%-100%.与对照相比,接种菌根真菌显著增加了植株磷含量,显著提高了多酚氧化酶的含量,降低了丙二醛浓度,促进了脯氨酸的积累.接种丛枝菌根真菌增强了植株对营养元素的吸收;促进植株生长;促进了植株体内酚类物质的氧化,抑制了病原菌的活性;降低了病原菌的侵染对细胞膜的破坏;有助于防止细胞质及组织脱水,从而抑制枯萎病的发生和发展,是一种有效的生物防治手段.同时,与接种Glomus.clarum相比,接种Glomus.etunicatum对枯萎病有较好的防治效果,说明不同菌根真菌对黄瓜枯萎病的防治效果存在差异.
关键字:丛枝菌根真菌,黄瓜枯萎病,次生代谢物
Biological Control of Fusarium Wilt Disease by Inoculation with Arbuscular Mycorrhiza Fungi and its Effect on Changes of some Secondary Metabolites in Cucumber
Abstract
The pot experiment was conducted to investigate the effects of two arbuscular mycorrhizal (AM) fungi species,Glomus .etunicatum and Glomus.clarum on the wilt disease Foxysporum f. sp. of cucumber seedlings under greenhouse condition. According to the transplant of horticulture cucumber production, the experiment was designed by inoculation with AM fungi (Glomus.etunicatum or Glomus.clarum) at germination and then with Fusarium 28 days later. The plants were harvest before inoculated Fusarium and 14 days after. Incidence and disease index of Fusarium wilt disease were determined, and the plant growth index and changes of some secondary metabolites.
The results showed that inoculation of AMF decreased the disease incidence and disease index significantly. The results also showed that inoculation increased phosphorus concentration of cucumber seedlings. The mycorrhizal seedlings had higher Polyphenoloxidase activity and concentration of praline but lower malondialdehyde than non-mycorrhizal seedlings. It indicated inoculation can promote the oxidation of hydroxybenzene, which can restrain the active of Fusarium, protect the membrane permeability in root and reduce the damage extent of cucumber seedlings by Fusarium. It was concluded that that mycorrhizal fungi can improve the growth and the wilt disease resistance ability of cucumber seedling. In addition the effect of inoculated Glomus.etunicatum was better than inoculated Glomus.clarum, which indicated that the influence of AM fungi on wilt disease was different.
Key Words: arbuscular mycorrhizal fungi, Fusarium wilt disease of cucumber, secondary metabolites目 录
1 前言 1
1.1 研究意义 1
1.2 丛枝菌根真菌提高植物抗病性研究进展 2
1.3 研究目的 3
2 研究思路 4
3 材料与方法 5
3.1 试验材料 5
3.2 试验设计 6
3.3 试验方法 6
3.4 指标测定 7
4 结果 8
4.1 侵染率 8
4.2 发病率和病情指数 8
4.3 生长及养分状况 9
4.4 次生代谢物 9
5 讨论 14
5.1 AM真菌侵染率变化及其影响 14
5.2 接种AM真菌和 Fusarium处理对黄瓜生长和营养元素含量的影响 14
5.3 接种AM真菌和 Fusarium对植株次生代谢物的影响 15
6 结论 16
7 展望 17
参考文献 18
致谢 20
1 前言
1.1研究意义
黄瓜因其栽培面积大,种植地域广,经济效益高,是我国最重要的蔬菜品种之一,在我国经济发展中起着及其重要的作用.据FAO统计,自1970年以来,我国黄瓜栽培面积一直居世界首位,而且逐年增加.我国黄瓜的栽培面积现占世界总栽培面积的56.51%;同时黄瓜产量一直居世界首位,占世界总产量的56.54%[1].
随着消费趋势及经济效益驱动,黄瓜连作面积的不断扩大,其连作病害日趋严重,已成为制约黄瓜生产发展的最重要因素.我国目前黄瓜常发生的病害有50余种,常年发生并造成较严重损失的病害有10余种,其中由土传病害引发的枯萎病,根腐病,疫病等尤为严重[2].
化学药剂对土传病害的防治取得了一定的效果,但化学药剂防治所引起的病原菌的抗药性和对有限水土资源的污染及其杀伤土居有益微生物等问题近年来引起了人们的重视.由于化学药剂难以实现高效的防治土壤有害微生物,从而导致农药大量使用和剧毒农药的使用[3,4].由于农药使用者缺乏农药知识和用药技术,长期,大量,不合理地使用,甚至滥用农药,致使目前我国约有87-107 万 hm2 的农田土壤受到农药污染,种植在农药污染的土壤上的作物从土壤中吸收累积农药,影响植物的正常生长发育,并在植物体内残留,对人类健康形成严重的威胁[3].农药污染已成为我国影响范围最大的一种有机污染[5].
鉴于当前使用化学农药存在较大的潜在的风险性,因此,在未来的农业中,如何大力建设和推广无公害农业,防止环境污染和破坏,达到社会,经济,生态的统一,使农业可持续发展,已成为全社会普遍关注的热点,而以发展可持续农业为宗旨的生物防治将在未来农业中将扮演重要的角色[6].生物防治即利用自然界的生物或生物制品减轻病虫的危害.其中主要包括各种天敌,微生物(真菌,放线菌等),这些有益微生物通过与病原菌竞争空间和营养源,产生抗生素,诱导植株产生系统抗性和真菌寄生作用等途径中的一种或几种从而抑制根部病害的发生.
丛枝菌根(arbuscular mycorrhiza,AM)真菌对提高作物土传病害的抗病性有着积极的作用,是当前生物防治土传病害的研究热点.AM真菌普遍存在于世界各地的土壤中[7].其宿主包括苔藓植物,蕨类植物,裸子植物和被子植物,据统计,地球上90%的维管植物都能形成丛枝菌根,在农业生态系统中大多数作物都能形成丛枝菌根[8].许多研究指出,AM菌与植物共生可以增加植物对矿质营养的吸收,特别是对磷的吸收能力增强,同时,还可以增强植物的抗逆性和抗病,耐病能力[9].在作物土传病害发生发展过程中,丛枝菌根真菌对植株抗病性能的影响,土壤中AM真菌群体多样性及其与其他微生物尤其是病原物比率和动态平衡,以及由此对宿主植物生理生化的影响是近年来菌根领域研究的热点之一.
1.2 丛枝菌根真菌提高植物抗病性研究进展
丛枝菌根真菌对植物病害的影响
Safir首次通过研究指出Glomus mosseaek可以减少病原菌Prenochaeta terrestris对洋葱根系的侵染,并能减轻根系红腐病的危害[10].此后,AM真菌与植物病害关系得到了广泛的重视,研究成果日益增多,并且应用上取得了很大进展.
由于植物根系是AM真菌与植株共生的作用部位,因此,研究多集中在植物的土传病害方向.研究结果表明,不同AM真菌和植物病原物之间的相互作用将随着宿主植物和耕作系统的不同而异,并且受到土壤类型等因子的影响,因而不同AM真菌所形成的菌根对提高植物抗病性的能力不同.通常认为AM真菌可以不同程度地减轻由病原真菌引起的病害,丛枝菌根真菌对土传病原物具有一定拮抗或抑制作用,能提高植物对土传病害的抗/耐病性[11,12].
Matsubara et al调查菌根性茄子在接种黄萎病菌(Verticillium dahliae)后的反应发现,其株高,茎粗,叶片数等均高于对照,始花期推迟,发病时间延迟,发病程度降低[13].李敏等研究发现,AM真菌能显著降低西瓜根围土壤和根内枯萎病镰刀菌繁殖体数量,减轻枯萎病的发病率和病情指数,对西瓜枯萎病的相对防效也达50%以上[14].Andrea的研究证实,在田间土壤不灭菌的条件下,育苗时接种Glomus sp.Zac-19可使移栽后的洋葱比不接种对照推迟2周发生白腐病且防效期长达11周,同时可增产21.7%;在土壤灭菌条件下,育苗时接种比移栽时接种Glomus sp.Zac-19的菌根抗病效果明显[15].
Caron指出在菌根根际,AM真菌在其中起着抑制土壤有害微生物,促进有益菌生长的作用,可以用做生防菌[16].因此,菌根作为生物防治的一种手段去控制植物病害尤其是土传真菌和线虫病害的发生和为害的潜力应进行进一步的挖掘.
1.2.2 丛枝菌根真菌提高植物抗病性的机制
刘润进和裘维蕃首次证实了VA 菌根菌的"丛枝"着生率与抗病性的密切关系并指出:AM菌根的抗,耐病功能主要是通过间接和直接作用来实现的[17].间接作用即通过改善植物的矿质营养,水分状况,促进生长发育等来提高植株的抗病性;直接作用即菌根真菌与病原菌的活力竞争及诱导生化拮抗物质来提高植株的抗病性.关于菌根真菌诱导植物的抗,耐病的作用机制存在这样几种假设[18]:
(1)促生作用:
相对与非菌根植物,菌根植物具有对于营养元素尤其是磷的吸收有较高大的能力.研究发现,菌根植物的生长反应及病原菌的侵染与施用磷肥的非菌根植物相似.Davis et al,Davis和Menge指出菌根真菌侵染对棉花黄萎病和柑橘根腐病的作用与磷营养水平的提高直接相关[19,20].
(2)竞争作用:
AM真菌和病原物均依靠宿主的光合作用产物,当AM真菌首先利用了光合产物,就会限制病原物的生长.Meyer和Linderman指出,菌根分泌物引起土壤中病原菌游动孢子囊和游动孢子数量显著下降[21].
(3)诱导抗性及诱导系统抗性:
植物的抗病生理生化机制很复杂,植物体内正常情况下保护酶系处于平衡状态下,而受病原物侵染后活性大大改变,表明植株体内保护酶系都是在与病原物相互作用中,主要是经病原物诱导而在抗病中起作用,因而在病原物初侵期测定保护酶含量的相对变化可以作为一个参考指标;而在无病地上这些酶的活性仅代表其正常情况下的代谢水平,在抗病中主要还是提高酶活性起作用.唐明娟和郭顺星认为:菌根通过刺激或增加宿主植物产生次生代谢物来提高其抗病能力[22].李海燕指出AM真菌具有活体营养特性,在其侵染植物根系过程中能诱导宿主植物产生防御反应,主要包括:(1) 植物细胞壁的加固;(2) 病程相关蛋白的积累;(3) 次生代谢的加强[23].
因此,AM真菌的侵染及其菌根的形成对于提高植物抗病性,保持植物健康状况具有重要意义.
研究目的
黄瓜枯萎病(Fusarium xysporum f. sp. cucumerinum)是保护地黄瓜栽培的毁灭性病害,是由半知菌亚门镰刀菌属的尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum (Sch1. ) Em end. Snyd. & Hans)引发的土传病害,该专化型致病菌为土壤习居菌,其厚垣孢子在土中或病残体中存5-6年,在多年连茬的黄瓜生产中黄瓜枯萎病逐年加重[24].病菌从幼根或伤口侵入寄生,使瓜叶迅速萎蔫且病势进展迅速,常年发病率一般为10%-30%,严重时可达80%-90%,甚至绝收[25].
柏素花和王倡宪等研究指出可以通过利用VA菌根对茄子,黄瓜等植物体营养的改善作用来培育壮苗[26,27];李敏等研究证实AM真菌能显著降低西瓜枯萎病的发病率和病情指数,并且先接种AM真菌,后接种镰刀菌的防病效果优于AM真菌与病原菌同时接种的效果[14].因此在农业生产中,一方面可以利用VA菌根对植物体营养的改善作用来培育壮苗,另一方面,可以根据接种VA菌根真菌后诱导植物体产生的系统性防御反应来提高植株的抗病性.
本研究利用设施园艺蔬菜生产中育苗移栽这一环节,将AM真菌作为一种生防技术在育苗时接种,并模拟移栽时保护地黄瓜生产中枯萎病危害,于生长一定时期接种尖孢镰刀菌(Fusarium),通过测定植株生物量,植株体内营养状况,根系多酚氧化酶(polyphenol,PPO)活性,丙二醛(malondialdehyde,MDA)和脯氨酸(praline)含量变化以研究丛枝菌根真菌在促进植株生长和提高抗病性能方面的作用.
本试验就丛枝菌根真菌抗病潜力做进一步的探索,为充分利用菌根真菌资源,克服保护地的土传病害提供一条兼顾经济效益与环境效益的新途径.
2 研究思路
将丛枝菌根真菌作为一种生防物质在育苗时接种,生长一定时间后接种尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.)用以模拟黄瓜生产中引发的枯萎病危害,在分别于接种病原菌之前和接种后14天收获.通过统计发病率和病情指数,测定生长以及次生代谢等指标探索接种AM真菌对黄瓜抗病效果的影响,并研究其抗病机理.其具体研究路线如图1所示.
图 1 研究技术路线
Fig. 1 Technological routs of research work
3 材料与方法
3.1 试验材料
供试植物
黄瓜:津绿3号(Cucumis sativa),为北京市昌平地区主栽品种,对枯萎病表现为非高感亦非高抗.
供试基质
草炭和蛭石(2:1)混合物高温蒸汽(121 ℃,2 h)灭菌,自然风干7 d后备用.理化性状见表1.
表1 基质理化性状
Table 1 character of substrate
pH
速效性N
NaOH-N (mg·kg-1)
速效性P
Olsen-P (mg·kg-1)
全P
Total P
(%)
速效性K
NH4Ac K (mg·kg-1)
有机质
Organic matter (%)
基质
Media
7.21
23.3
67.2
0.173
103.1
2.71
试验装置
塑料营养钵(上口径12 cm,底径8 cm,高10 cm),用福尔马林密封1周进行消毒处理,待气味散尽后备用.
菌剂
AM真菌:G.lomus etunicatum(G.e)与 Glomus.clarum(G.c),分别为河北农田和山东农田的优势种[28],两种AM菌剂为玉米和三叶草扩繁,含有真菌孢子和菌丝以及被侵染根段的接种剂.
枯萎病病原菌:Fusarium oxysporum f.sp. (F),由中国农业科学院植物保护研究所提供.
试验设计
为消除AM真菌菌剂由扩繁基质,以及其中微生物之间的差异所造成的影响,G.e和G.c分别设置了相应的对照处理.在播种时接种丛枝菌根真菌,并在植株生长28 d后进行接种病原菌处理.每种AM真菌均设空白,单接种AM真菌,单接种病原菌,AM真菌和病原菌双接种等4个处理,试验共设8个处理,具体处理如表2所示:
表2 试验处理及其代号
Table 2 Treatments of the experiment and abbreviations
处理号
Treatments codes
AM真菌
AM Fungus
病原菌
F.oxysporum f. sp
1
G.e-CK
-F
2
G.e
-F
3
G.e-CK
+F
4
G.e
+F
5
G.c-CK
-F
6
G.c
-F
7
G.c-CK
+F
8
G.c
+F
注:G.e-CK:灭菌G.e菌剂和经双层滤纸过滤的菌种滤液10ml;G.e:接种G.e;
G.c-CK:灭菌G.c菌剂和经双层滤纸过滤的菌种滤液10ml;G.c:接种G.c;
-F:不接种F.oxysporum f. Sp ;+F:接种F.oxysporum f. Sp.
G.e-CK:sterilized G.e and filtrate 10ml; G.E:inoculated with G.e;
G.c-CK:sterilized G.c and filtrate 10ml; G.c:inoculated with G.c;
-F:noninoculated by F.oxysporum f. Sp; +F: inoculated by F.oxysporum f. Sp.
每个处理重复10次,随机排列.
试验方法
试验于2004年3-6月在北京农学院日光温室内进行.
病原菌培养:取病原菌在PDA培养基上培养4天,然后从菌落边缘挑取3-4 mm菌块于PDA液体培养基中25 ℃,50 rpm培养2周,用灭菌的双层纱布滤掉菌丝,将剩余的培养液4 ℃,9000 rpm离心3次,收集孢子悬液,血球板计数,最后用10 m mol L-1 MgSO4 7H2O调节孢子浓度至1×105 枚/ml.
种子处理:播种前将充分吸水的黄瓜种子在10% H2O2中浸泡10 min进行表面消毒,用蒸馏水洗净药液后温汤浸种2 h,取出于28 ℃恒温箱中黑暗催芽.
装盆:每盆装入经充分混匀的180 g育苗基质和15 g AM菌剂,不接种的对照则加入等量的灭菌菌剂和经双层滤纸过滤的菌种滤液10 ml,以保证其它微生物种类的一致性.每盆播种2粒,出苗定苗一株.
病原菌接种:植株生长28 d后,采用灌根法接种病原菌孢子悬液,每盆施用10 ml.对照处理灭菌水代替病原菌孢子悬液.
试验管理:植株生长过程中每周施用50%浓度的霍格兰营养液加阿农微量元素混合液营养液(其中柠檬酸铁用EDTA-Fe代替)10 ml[29],保证养分的供应.常规管理.
3.4 指标测定
试验分接种病原菌前和接种病原菌14天后两批收获.
接种病原菌期间统计发病率,根据植株发病程度及病情分级标准计算病情指数.
苗期黄瓜枯萎病病情分级标准按方中达的方法[30],按照表3进行统计:
表 3 黄瓜枯萎病病情分级标准表
Table 3 Levels of the Wilt disease of Cucumber
级别
Levels
病情
Wilt disease
0
无症状
1
真叶,子叶黄化或萎蔫面积不超过总叶面积的50%
2
真叶,子叶黄化或萎蔫面积超过总叶面积的50%
3
叶片萎蔫或枯死,仅生长点存活
4
病株枯死
植株发病程度及病情分级标准计算病情指数按吴营昌的方法[31],按照公式1,2进行计算:
病情指数(%)= *100 (1)
相对防治效果(%)=(对照病情指数-处理病情指数)/ 对照病情指数×100 (2)
每次收获每个处理均随机取样3株,取后迅速分割地上部与根系,主要测定指标有植株生物量,植株体内营养状况,根系多酚氧化酶(PPO)和过氧化物酶(POD)活性,丙二醛和脯氨酸含量.
菌根侵染率的测定采用网格交叉法:选取一定量的细根(侧根),每个样品加10%的KOH在90℃下水浴消解20 min;拿出冷却,倒出KOH并加2%HCl 酸化5 min;用曲利苯蓝染色,在90℃下水浴30 min;冷却,加1:1的乳酸甘油,在室温下脱色[32].然后选取30条根段(约1 cm左右),用网格交叉法[33]进行侵染率的测定.
植株全N,全P采用H2SO4-H2O2消煮法,含量用流动注射分析仪(FIA2400型)测定;K,Ca,Mg,Fe,Mn,Cu和Zn采用1 mol/L的HCl浸提,含量用原子吸收分光光度计(WFX-1C型)测定.
PPO酶活性的测定参照胡风庆的方法[34]:取0.5 g洗净混匀去主脉新鲜叶片,加入5 ml 0.05 mol/L buffer冰浴研磨,10000rpm离心15min,收集上清液用于酶活性的测定.3.8ml 0.05 mol/L pH6.8 PBS,0.1M邻苯二酚1 ml,上清酶液0.2 ml,35 ℃水浴20 min,立即冰水浴中,以PBS调零.酶活性单位(1U)定义为每分钟内OD398变化0.01个单位.
酶测定时组织蛋白含量的测定采用Lowry法[35]:取0.5 ml代测酶液加入5 ml碱铜试剂,显色反应10 min,再加入0.5 ml酚啉试剂反应30 min,于650 nm比色.
丙二醛和脯氨酸含量均采用分光光度法测定[36].
试验数据均采用SPSS(11.0)软件进行统计分析,多重比较采用LSD法.4 结果
4.1侵染率
由表4可以看出,单接种G.e的处理黄瓜在苗期在接种Fusarium14 d后侵染率与接种Fusarium之前的增长并不明显,但接种G.c有显著的提高;接种病原菌显著的降低了AM真菌的侵染率,G.e和G.c均达到了显著的水平,分别降低了15.3%和58.4%.与单接种G.c的处理相比单接种G.e的处理侵染率始终较高,且其之间的差异达到了显著水平.
表 4 不同处理黄瓜AM真菌侵染率
Table 4 Mycorrhizal colonization of cucumber
处理
Treatments
AM真菌侵染率(%)
Mycorrhizal colonization
0d
14d
1
0c
0e
2
36a
37a
3
0c
0e
4
36a
32b
5
0c
0e
6
13b
27c
7
0c
0e
8
13b
17d
注:处理缩写参照表2.各列不同字母表示α=0.05水平差异显著.
0d : 接种病原菌(Fusarium)0天;14d:接种病原菌(Fusarium)14天.下同.
Abbreviations as in table 2. Different letters in columns means significant difference at α=0.05 level;
0d : 之前 after inoculation Fusarium; 14d : 14 d after inoculation Fusarium. The same as below.
4.2发病率和病情指数
由表5可知,接种AM真菌可以降低黄瓜枯萎病的发病率和病情指数,单接种病原菌Fusarium的处理发病率高达10%~30%,而AM真菌和病原菌双接种的处理发病率为0~10%,接种丛枝菌根真菌的相对防治效果高达66%~100%;不同AM真菌的抗病效应存在差异, G.e处理的效果优于G.c.
表5 黄瓜枯萎病的发病率和病情指数
Table 5 Incidence and Disease index of Fusarium wilt of cucumber
处理
Treatments
发病率
Incidence
(%)
菌根效应
Mycorrhizal effects
(%)
病情指数
Disease index
(%)
相对防效
Relatively resistance
(%)
1
0.0
0.0
2
0.0
0.0
3
10.0
2.5
4
0.0
100
0.0
100
5
0.0
0.0
6
0.0
0.0
7
30.0
7.5
8
10.0
67
2.5
67
注:接种病原菌14d后测定结果
Data were collected at 14d after inoculation Fusarium
4.3生长及养分状况
4.3.1 生长性状
植株的株高,茎粗,叶面积在接种Fusarium之前有微小的波动,但差异不显著(表6),
在接种病原菌Fusarium 14d后各项指标均较之前有显著提高,单接种G.e的处理相对于单接种病原菌Fusarium的处理叶面积有显著的升高,但接种G.c差异并不显著.
表6 生长性状
Table 6 growth character of cucumber
处理
Treatments
株高Height
(cm)
茎粗Thickness
(mm)
叶面积Leave Area
(cm2)
0d
14d
0d
14d
0d
14d
1
13.4a
44.0ab
5.8ab
6.6abc
360.0a
583.2ab
2
12.9a
48.9ab
6.2a
6.5abc
366.1a
764.1a
3
13.4a
41.8ab
5.8ab
5.7c
360.0a
481.6b
4
12.9a
44.5ab
6.2a
6.4abc
366.1a
561.4ab
5
9.7b
43.6ab
5.5ab
6.0bc
220.3b
535.9ab
6
10.3b
50.2a
5.0b
7.2a
217.6b
787.7a
7
9.7b
43.3ab
5.5ab
6.8ab
220.3b
636.5ab
8
10.3b
39.5b
5.0b
5.9bc
217.6b
525.9ab
由表7可知,植株鲜重,干重在接种病原菌Fusarium之前的均未表现出显著的差异.在接种病原菌Fusarium 14d后较之前有显著提高;相对于单接种病原菌Fusarium的处理,单接种G.e处理的鲜重增长了13.1%,干重增长了19.7%,差异显著;单接种G.c的处理差异不显著.两种丛枝菌根真菌之间也产生了一定的差异,接种G.e的处理的各项指标均较G.c有所升高.
表 7 丛枝菌根真菌黄瓜地上部生物量
Table 7 The biomass of infected and nonmycorrhizal cucumber above part
处理
Treatments
鲜重Fresh weight
(g)
干重 Dry weight
(g)
0d
14d
0d
14d
1
11.85a
34.25a
1.11a
3.71ab
2
12.48a
38.72a
1.22ab
4.44a
3
11.85a
27.01a
1.11a
3.11b
4
12.48a
34.35a
1.22ab
3.92ab
5
7.31b
29.53a
0.69c
3.84ab
6
7.60b
39.37a
0.79bc
4.01ab
7
7.31b
31.05a
0.69c
3.64ab
8
7.60b
30.94a
0.79bc
3.33b
4.3.2 营养元素含量
由表8可以看出,接种Fusarium之前时,接种AM真菌对地上部N的含量并显著影响;接种G.e的处理地下部的N的含量要显著高于对照;接种Fusarium14 d时,地上部的N含量并没有显著差异.
接种Fusarium之前时,单接种G.e处理地下部和地上部相对与其对照P的含量均表现出明显的提高(表8);但是接种G.c处理没有显著的差异;接种Fusarium14 d时,所有处理与前期相比P的含量都有一定程度的下降;地上部单接种Fusarium的处理与其他处理相比明显的下降,地下部的单接种AM真菌和与Fusarium双接种的处理与对照相比呈现显著的提高.
表 8 不同处理黄瓜地上部和地下部氮磷含量
Table 8 Nitrogen (N) and Phosphorus (P) concentration in shoots and roots of the cucumber
处理
Treatments
N(%)
P(%)
地上部
Shoots
地下部
Roots
地上部
Shoots
地下部
Roots
0d
14d
0d
14d
0d
14d
0d
14d
1
3.30a
2.78a
3.22a
2.42abc
0.34ab
0.23ab
0.15c
0.14b
2
3.33a
3.10a
4.00a
2.89a
0.40a
0.28a
0.25a
0.25a
3
3.30a
3.27a
3.22a
2.21bcd
0.34ab
0.15b
0.15c
0.17b
4
3.33a
2.53a
4.00a
2.49abc
0.40a
0.29a
0.25a
0.27a
5
3.59a
2.58a
3.72a
1.89cd
0.24b
0.14b
0.20b
0.12b
6
3.74a
2.81a
3.55a
1.60d
0.28b
0.15b
0.19b
0.14b
7
3.59a
3.41a
3.72a
1.75d
0.24b
0.19ab
0.20b
0.12b
8
3.74a
3.26a
3.55a
2.79ab
0.28b
0.27a
0.19b
0.27a
由表9可知,接种Fusarium之前时,菌根化与否对K,Ca的含量的提高有显著的影响,但对Mg,Fe,Mn,Cu,Zn等未表现出明显的影响.接种Fusarium14 d时,各个处理相对接种Fusarium之前时各种元素的含量均有不同程度的下降,其中K,Mg,Fe,Zn等达到了显著水平;各个处理之间除Cu外,均未表现出显著差异,单接种G.e的处理相对与对照和单接种Fusarium的处理有了显著的提高,但单接种G.c的处理则正好相反.
表9 不同处理黄瓜地上部其它营养元素含量
Table 9 Mineral contents in the shoots of the cucumber
处理
Treatments
K
(%)
Ca
(%)
Mg
(%)
0d
14d
0d
14d
0d
14d
1
3.1b
2.5ab
0.26ab
0.19d
0.27b
0.16e
2
3.6a
2.6a
0.31ab
0.27b
0.25b
0.22cd
3
3.1b
2.8a
0.26ab
0.23cd
0.27b
0.19d
4
3.6a
2.7a
0.31ab
0.24c
0.25b
0.23c
5
2.1c
1.9c
0.35a
0.28ab
0.49a
0.36a
6
2.6bc
2.5ab
0.20b
0.22d
0.21b
0.20cd
7
2.1b
2.2bc
0.35a
0.29a
0.49a
0.30b
8
2.6bc
2.4ab
0.20b
0.25c
0.21b
0.22c

(续表9)
处理
Treatments
Fe
(mg/kg)
Mn
(mg/kg)
Cu
(mg/kg)
Zn
(mg/kg)
0d
14d
0d
14d
0d
14d
0d
14d
1
114b
71e
42a
54a
7.8a
4.4c
8.2a
6.3abcd
2
109b
81e
53a
45cd
6.5a
7.5a
8.1a
7.2a
3
114b
101cd
42a
46cd
7.8a
4.8c
8.2a
5.5d
4
109b
113bc
53a
51ab
6.5a
6.8ab
8.1a
6.2bcd
5
183a
138a
44a
25f
7.7a
6.5ab
8.4a
6.7abc
6
92b
95d
36a
43d
5.6a
4.8c
5.5b
5.6d
7
183a
122b
44a
36e
7.7a
6.2b
8.4a
6.8ab
8
92b
111bc
36a
48bc
5.6a
4.3c
5.5b
5.8cd
4.4 次生代谢物
4.4.1多酚氧化酶活性(U)及酶比活
由表10可知,地下部中多酚氧化酶活性(U)无论在接种Fusarium之前和各个处理均未表现出显著的差异,虽然酶比活变化在接种Fusarium14 d较接种Fusarium之前表现出明显的下降,但同一时期的各个处理之间的变化并不显著.
表 10 地下部中多酚氧化酶活性(U)及酶比活变化
Table 10 Polyphenoloxidase activity (U) and specific activity in roots
处理
Treatments
U
比活(U/mg蛋白)
Specific activity(units/mg protein)
0d
14d
0d
14d
1
34.1a
30.4a
9.55a
5.57a
2
36.7a
31.8a
10.37a
5.80a
3
34.1a
32.5a
9.55a
6.71a
4
36.7a
25.5a
10.37a
6.71a
5
32.5a
26.6a
8.88a
6.28a
6
37.2a
22.7a
10.58
5.35a
7
32.5a
32.4a
8.88a
6.45a
8
37.2a
31.3a
10.58a
7.26a
由表11可以看出,地上部多酚氧化酶的活性在接种Fusarium之前各个处理之间并没有表现出显著的差异;在接种Fusarium14 d,除单接种Fusarium的处理外,其他处理相对于前一个时期有了显著的增长;单接种AM真菌与对照相比有了显著的升高;AM真菌和Fusarium双接种的处理其他处理的酶活性相比最高,其差异达到了显著水平.
表 11 地上部中多酚氧化酶活性(U)及酶比活变化
Table 11 Polyphenoloxidase (PPO) activity (U) and specific activity in shoots
处理
Treatments
U
比活(U/mg蛋白)
Specific activity(units/mg protein)
0d
14d
0d
14d
1
78.0a
92.3e
17.93a
17.93c
2
91.9a
123.5c
21.52a
22.52bc
3
78.0a
74.5f
17.93a
17.71c
4
91.9a
137.5b
21.52a
28.40ab
5
92.4a
100.8de
21.35a
17.92c
6
93.5a
112.4cd
20.49a
21.96bc
7
92.4a
91.2e
21.35a
18.10c
8
93.5a
160.8a
20.49a
33.85a
4.4.2 丙二醛含量
各个处理地上部丙二醛的含量见图2.接种Fusarium之前丙二醛的含量一直处于较低的水平,接种Fusarium14d,单接种Fusarium的处理丙二醛含量显著高于其他处理,双接种AM真菌和Fusarium的处理与对照相比则没有显著的差异,较相应单接种病原菌处理丙二醛含量分别降低14.7%和23.6%,且差异显著.

图2 各个处理地上部丙二醛浓度
Fig.2 Concentration of malondialdehyde in shoots of the treatments
注:处理缩写参照表2.下同.
Abbreviations as in table 2. The same as below.
脯氨酸含量
由图3可知,接种 Fusarium之前,各个处理之间没有显著的差异;接种Fusarium14 d之后,单接种AM真菌的处理脯氨酸的含量相对对照有明显的升高,单接种病原菌Fusarium的处理较空白也有不同程度的提高,同时接种AM真菌和Fusarium的处理比单接种AM真菌和Fusarium的处理有了很大的增长,达到了显著水平.
图3 各个处理地上部脯氨酸浓度
Fig. 3 Concentration of praline in shoots of the treatments
5 讨论
5.1 AM真菌侵染率变化及其影响
单接种AM的处理黄瓜苗期在接种Fusarium14 d之后侵染率与接种Fusarium之前有不同程度的增长,其中接种G.c达到了显著水平,说明此试验中黄瓜苗期植株与AM真菌共生系统正在形成的阶段,这与王秀芹和张福墁的试验结果相一致[37].此次试验是在春季进行的,刘润进和李晓林指出春季丛枝菌根生长发育较为缓慢,夏季则达到高峰[12],本研究植株生长过程中,真菌主要进行营养生长,随着试验的进行,气温逐渐升高,侵染率也不断的升高.
接种病原菌显著的降低了两种AM真菌的侵染率,说明病原菌能抑制AM真菌的侵染,对共生系统的进一步形成和发育有较强的拮抗作用,与刘润进等指出的黄萎病菌Verticillium dahliae能减少丛枝菌根真菌对棉花根系的侵染数量的结果类似[38].研究表明病原微生物可以抑制丛枝菌根真菌的萌发[39],及存在侵染竞争关系[14],本试验结果表明病原菌同样会对AM真菌的生长发育和侵染产生较大的影响.
本试验中单接种G.c的处理与单接种G.e的处理相比侵染率始终较低,说明不同的AM真菌与宿主的共生关系的建立之间会有较大差异,造成这种差异的原因可能由于菌根真菌和宿主植物自身的特征[40],AM真菌与宿主植物的组合,接种剂的构成以及基质构成等多项因素的因素构成.
5.2 接种AM真菌和Fusarium处理对黄瓜生长和营养元素含量的影响
本试验中单接种AM真菌的促进作用在接种Fusarium14 d后才形成显著的差异,经过一定时间积累的基础上才表现出来,王秀芹和张福墁指出春季日光温室黄瓜苗期处于低温寡照环境,不利于AM真菌与黄瓜共生[37],因此AM真菌对幼苗生长性状的促进作用不明显,随着时间的增加,丛枝菌根真菌的接种效应逐渐积累,促进作用逐渐增强.单接种AM真菌处理相对与对照株高,茎粗,叶面积等均没有显著的差异,与Matsubara等调查菌根化茄子在接种黄萎病菌(Verticillium dahliae)得出的株高,茎粗,叶片数等均高于对照的研究结果有一定的差距[14],关于AM真菌能否促进植株生长性状指标有待于进一步的试验证实.
接种Fusarium时,由于植株处于快速生长时期,生长量的积累大于营养元素的积累而形成"稀释效应",相对与接种Fusarium之前均有不同程度的下降.在整个试验进行过程中,地下部的N含量单接种G.e的处理要显著高于对照,说明接种G.e的处理对增强N的吸收有一定的促进作用,与Ames等试验结果相一致[41].单接种G.e处理地下部和地上部相对与其对照均表现出P的含量明显的提高,与现有观点相吻合[42];单接种G.e的处理相对与对照和单接种Fusarium的处理显著提高,单接种G.c的处理则相反,说明接种AM真菌对于植株吸收Cu的影响在不同的菌种之间也存在着差异.接种丛枝菌根真菌后,植株的养分浓度(主要是N和P)明显升高,说明菌根化植株从基质中吸收矿质营养的能力都有不同程度的提高,但不同的AM真菌之间存在差异,这与其不同的侵染率以及AM真菌和宿主植物的组合有关.AM真菌的促生效应与其对根系从基质中吸收矿质养分,尤其是部分难移动的营养元素(P,Cu,Ca)的改善作用有关.
接种病原菌Fusarium的处理与对照相比生长性状降低程度并不显著,但单接种Fusarium的处理与其他处理相比营养元素含量有了明显的下降.由于接种病原菌Fusarium时间较短,发病程度较低,对植株的生长的抑制作用并没有在量上形成足够的积累,但镰刀菌侵染破坏了根系的膜系统[43],造成代谢紊乱,根系防卫机能丧失,活力下降,使地上部缺水萎蔫,影响了对矿质元素的吸收,并使其与对照的差异达到了显著水平.
丛枝菌根真菌与接种病原菌双接种的处理与对照相比生物量的差异不显著;其与单接种丛枝菌根真菌相比,有了一定程度的降低;同时与单接种病原菌相比,也有一定程度的增高,说明接种丛枝菌根真菌促进植株生长,抑制了病害的产生的同时,病原菌的侵入导致植株根系的病理组织变化,影响植株正常的生长代谢活动对丛枝菌根真菌的促生效应同样产生了影响.
两种丛枝菌根真菌之间也产生了一定的差异,相对而言,接种G.e处理的效果优于G.c,说明接种G.e形成了相对较好的共生系统.
5.3 接种AM真菌和Fusarium对植株次生代谢物的影响
地下部中多酚氧化酶活性在整个试验过程中各个处理均未表现出显著的差异,地上部AM真菌和Fusarium双接种的处理比相对他处理的酶活性最高,且达到了显著的水平,说明在接种Fusarium的菌根化植株对病害能促进植株多酚氧化酶活性的提高,而多酚氧化酶(PPO)是酚类物质氧化的主要酶,酚类物质能氧化产生可以杀死或抑制病原菌繁殖的醌类[44],研究表明多酚氧化酶的活性的提高与植株的抗病正相关[45,46],因此接种AM真菌在病原菌侵染的过程中促进了多酚氧化酶的形成和积累,有效阻止的病原菌侵染及在体内扩展,有助于提高植株的抗病性.
接种病原菌后,非菌根化处理根系丙二醛含量略有升高,而接种AM却可在一定程度上降低植株根系丙二醛含量,而丙二醛作为膜脂过氧化作用的最终产物,它的含量是膜脂过氧化程度的一个重要标志,而且与细胞膜的损害程度直接相关[47].王建明等试验结果表明,宿主在受到病原菌侵染后,抗病品种体内丙二醛含量比对照的增加比率明显低于感病品种[48],因此本试验中AM共生体的形成降低了细胞中丙二醛的含量,从而降低了病原菌对根细胞膜的伤害,这样就在一定程度上维持了细胞膜结构的稳定性和完整性,因此接种丛枝菌根真菌通过保持植株根系的正常代谢,从而提高植株的抗病性.
双接种AM真菌和Fusarium的处理比单接种AM真菌和单接种Fusarium的处理地上部脯氨酸浓度有了明显的增长,而游离脯氨酸的积累是植物遭受各种环境胁迫产生的一种普遍现象[49],脯氨酸增加有助于防止细胞质及组织脱水,可缓解对膜系统的伤害[50].郭红莲等指出脯氨酸含量比对照升高的值与发病情况呈显著负相关[51],说明在病原菌侵染的逆境条件下,细胞内游离脯氨酸变化可能是抵抗病原菌侵染的机制之一.本研究表明在接种Fusarium诱导的情况下,接种AM真菌植株可通过积累脯氨酸来缓解病菌侵染伤害的作用程度.
6 结论
1. 接种丛枝菌根真菌有效的降低了黄瓜枯萎病的发病率和病情指数;
2. 接种丛枝菌根真菌促进了植株N,P的吸收;
3. 接种丛枝菌根真菌对植株的次生代谢的影响:增加了植株多酚氧化酶的含量,降低了丙二醛的浓度,促进了脯氨酸的积累;
4.接种G.e效果优于接种G.c的效果,说明不同AM真菌之间存在差异.
试验结果表明接种丛枝菌根真菌能有效的促进植株生长,抑制枯萎病的发生和发展,是一种潜在的高效生物防治手段.
7 展望
越来越多的试验证实丛枝菌根真菌对增强植株抵抗土传病害有重要作用,针对其机理的研究成果不断涌现,并日趋成熟;在细胞和分子水平上VA菌根真菌与根际微生物的研究也不断深入,VA菌根真菌对改善植株生长和增强植株抗病性关系的研究已日趋完善,为VA真菌在农业生产中的应用提供理论依据和实践指导.
由于试验材料和研究条件的限制,所获信息尚不能全面评价丛枝菌根真菌的作用,同时丛枝菌根真菌对植株生长的促进作用和有害微生物造成病害的耐性和抗性等方面的许多观点仍处于假说阶段,丛枝菌根真菌及土壤其他微生物包括有益和有害微生物的侵染对根系乃至植株生理的影响,理解这些生理学和生态学的变化对于植株抵御病害的意义,需要进一步的研究.
采用不同背景和生物学特性的真菌材料进行比较研究,并且考虑到真菌材料的生态适应性和宿主的适应性,或者说菌种抗病性的变异可能性与其土壤条件,宿主植物的关系,选择适宜的丛枝菌根真菌--病原菌--植物种类的适宜组合,充分发掘丛枝菌根真菌提高植物抗病性的潜力.在室内研究其机理的同时,考虑到其条件单一,有必要将研究扩展到田间,通过田间控制和模拟试验,研究丛枝菌根真菌的表现,而且有必要考虑多种影响因素,实现多样性材料的引入,深入细致的进行系统化研究.
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致谢
本项研究是在导师李晓林教授,秦岭教授悉心指导下完成的.从研究方向的确定,试验方案的实施,到论文写作等方方面面两位导师都倾注了的大量心血.导师渊博的学识,开阔的思路,严谨的治学态度,忘我的工作作风,谦和的人格魅力都将使我终身受益.在试验开展期间,无论从工作还是生活都得到导师无微不至的关怀,在此向他们表示衷心的感谢!
感谢冯固教授在试验设计中给予的热情指导.
感谢博士研究生生王倡宪同学在对试验顺利进行所作的各种努力和生活上方方面面的照顾,感谢其给予的关怀和帮助!在研究进行过程中,科学严谨的态度,孜孜不倦工作精神让我受益匪浅.
感谢博士生研究生刘于,郭涛同学在论文写作阶段给予的大力帮助.
感谢盖京萍博士,博士研究生刘文科同学以及农学院的王绍辉,程继鸿,董清华,贾月慧老师,马焕普研究员,硕士研究生冯永庆,关美枝同学在试验进行中提供的热情帮助.
感谢英国Belfast女王大学Peter Christie博士对菌剂比较方面给予的指导.
感谢多年来给我精神物质支持的父母及家人.
再次向所有关心和帮助支持我的老师和同学致以最真挚的感谢!
郝志鹏
2004年5月
中国农业大学学士学位论文 摘要
中国农业大学学士学位论文 目录
中国农业大学学士学位论文 前言
中国农业大学学士学位论文 研究思路
中国农业大学学士学位论文 材料与方法
中国农业大学学士学位论文 结果
中国农业大学学士学位论文 结论
中国农业大学学士学位论文 展望
中国农业大学学士学位论文 参考文献
中国农业大学学士学位论文 致谢
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