猬迭宫绦虫幼虫含重复序列的cDNA的分子克隆

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内容摘要：

◇论著◇
猬迭宫绦虫幼虫含重复序列的cDNA的分子克隆
刘殿武,朱冰,王晓波,丁月新,刘树贤
【摘要】目的从分子水平研究猬迭宫绦虫幼虫——裂头蚴的某些蛋白抗原的基因结构.方法
用鼠抗裂头蚴多克隆抗体筛选裂头蚴cDNA文库,筛选出的阳性克隆,经亚克隆,测序后,分析其
一级结构特点.以克隆出的cDNA作探针进行N o r the rn杂交实验,检测m RNA的长度.结果从
cDNA文库中筛选出两个克隆(长度分别是366bp和458bp).两个克隆的5'端都没有起始密码;
3'端都没有po ly(A),但是其中一个克隆有po ly(A)信号.两个克隆都有一个由123个核苷酸组成
的重复单位,其中只有一个核苷酸不同.重复单位编码的41个氨基酸内有一个糖基位点,中性氨
基酸占41. 46%.N o r the rn杂交结果显示,裂头蚴从1. 5kb到4kb处有多个很强的杂交带,而成
虫没有杂交带.结论裂头蚴体内含有丰富的由重复单位组成的分子量大小不同的抗原.
【关键词】迭宫绦虫属遗传学;裂头蚴属寄生虫学;cDNA 遗传学
【中图分类号】R532. 3;R394. 3 【文献标识码】A 【文章编号】100826013(2001)0420294204
M olecularclon ingoftwof ragm en tsofcD NAcon ta in ingrepea tun itsinSp irom e t rae r ina ce ieu rop a e i
L IUD ian2w u,ZHUB ing,W AN GX iao2bo,D IN GYue2x in,L IUShu2X ian.D ep a rtm en tof
Ep id em iology,H ebeiM ed ica lU n iv ersity,S h ij iaz huang050017,C h ina
【Abstract】 O bject ive Ino rde rtostudythegenest ructu reenco d ingsom ean t igen icpo lyp ep t ide s
o fp le ro ce rco ido fsp irom etraerinaceieu rop aei(SEP).M ethods AcDNAlib ra ryco n st ructedf rom
SEPw a simm uno screenedu singm o u sean t i2SEPpo lyclo na lan t ibo dy.T hegenest ructu rew a s
ana lyzedbycom p u te raf te rthein se r t so fpo sit iveclo new e resubclo nedandthenucleo t ide
sequence so fthein se r t sw e rede te rm ined.T heleng tho fm RNAhyb r id izedw a sde tectedby
N o r the rnb lo tw ithcDNA.Results Tw ocDNAclo ne sw e reiso la ted,o neo fw h ichw a s366bp
andano the r458bp.T hein it ia t io nco do n so fthetw oclo ne sw e reno tfo undinthe5'te rm ina land
po ly(A)ta ilsno tfo undinthe3'te rm ina lso fthetw oclo ne sbu to neo fw h ichhadpo ly(A)
signa l.T heop enread ingf ram e so fthetw oclo ne sbo thco n ta inedtandemrep ea t ingun ito f123bp
w h ichapp ea red3t im e sino neclo neand2t im e sinano the r.O n lyo nenucleo t ideo fthe123bp
rep ea t ingun ito fthetw oclo ne sw a sd iffe ren t.T he41am inoacid sdeducedf rom123bprep ea t ing
un it,w h ichco n ta inedapo ten t ia lg lyco sy la t io nsiteinthem idd le,co n sistedo f41. 46%o fneu t ra l
am inoacidre sidue s.InN o r the rnb lo ta ssay,seve ra lclea rband sf rom1. 5kbto4kbw e reshow n
inp le ro ce rco id sbu tno tinadu ltw o rm s.Conclus ion s T hep le ro ce rco idco n ta in sm anyk ind so f
po lyp ep t idean t igenw h ichco n sisto frep ea t ingun it s.
【Keywords】 spirometra gene t ics;Sparganum p a ra sito lo gy;cDNA gene t ics
(ChinJDisControlPrev2001,5(4): 2942297)
猬迭宫绦虫是一种人畜共患的寄生虫,其幼虫
——裂头蚴寄生在爬行类和两栖类动物体内,如蛇
和青蛙.人食入未经加热处理的带有裂头蚴的蛇肉
或蛙肉,或用蛙肉覆盖伤口和炎症部位时感染.幼虫
【基金项目】河北省科技厅和河北省教育厅资助(97205)
【作者单位】河北医科大学流行病学教研室,河北石家庄
050017
【作者简介】刘殿武(1956-),男,满族,河北承德人,教授,
博士生导师.主要研究方向分子流行病学.
感染人后,可移行或停留在机体各组织器官内,如皮
下,肌肉,眼,阴囊等部位,引起裂头蚴病.有时可寄
生到中枢神经系统引起致死性疾病 1, 2 .裂头蚴可产
生多种蛋白酶,如酪蛋白溶解酶 3 ,羧酸蛋白酶 4 ,
半胱氨酸酶 5 等,破坏机体组织,引起病变.在基因
研究方面,多种基因如编码半胱氨酸酶的基因 6 ,
18SrRNA的基因 7 及编码带有重复序列蛋白抗原
的基因 8, 9 已被克隆.为了进一步研究裂头蚴在宿主
体内是否分泌其他抗原及其编码抗原的基因特点,
现用鼠抗裂头蚴多克隆抗体筛选裂头蚴基
492 C h inJD isC on trolP rev 2001 D ec;5(4)
因文库,从中选出阳性克隆,测序后研究其一级结构
特点.
1 材料与方法
1.1 抗体和cD NA基因文库鼠抗猬迭宫绦虫幼
虫多克隆抗体和裂头蚴cDNA文库,由日本信州大
学医学部寄生虫学教研室菅根一男教授惠赠.
1.2 RNA的提取猬迭宫绦虫取自日本长野县的
狗,其幼虫取自日本鼠蛇(elaphequadrivirgata),
取出的成虫和幼虫洗净后- 70℃保存备用.按
Chom czyn sik等 10 的酸性异硫氰酸胍一步法提取
总RNA,然后将总RNA过O ligo(dT)纤维素柱
(Tw oO akPa rk,B edfo rd,M A0173)提取m RNA,
- 70℃保存备用.
1.3 cD NA文库的筛选 Kg t11cDNA文库转染
大肠杆菌Y1090, 42℃培养出噬菌斑后,覆盖含
IPT G的硝酸纤维素滤膜, 37℃再孵育2h诱导产生
融合蛋白.非对称标记后,取下硝酸纤维素滤膜用鼠
抗裂头蚴多克隆抗体进行筛选 11 .
1.4 核苷酸序列测定及同源性检测 cDNA插入
物从Kg t11载体上切下,回收后,与pU C18质粒载
体进行亚克隆,筛选并用限制性内切酶消化检测插
入片断的长度.以双脱氧核苷酸末端终止法用T aq
D yeD eoxyT erm ina to rCycle测序试剂盒(购自
A pp liedB io sy stem s,Inc.CA)测定cDNA的核苷酸
序列,通过In ternet网与GenB ank内登录的序列进
行同源性分析.在M acin to shL C630微机上应用
GEN ET YX软件分析cDNA编码的基因序列.
1.5 Northern印迹杂交 2Lgpo ly(A)+RNA在
1. 2%的琼脂糖凝胶中电泳后,按标准方法 11 将其
转移到尼龙膜上(H ybond2N+,Am ersham)与32P
dN T P标记的cDNA探针在42℃杂交16h.杂交后
将膜用2×SSPE 0. 1%SD S和1×SSPE 0. 1%
SD S液42℃各洗1次, 0. 1×SSPE 0. 1%SD S室温
洗1次.
2 结果
2.1 阳性克隆的筛选从cDNA文库中大约取6
×104重组克隆,用鼠抗裂头蚴抗体进行筛选.选出
7个阳性克隆,再经过2次筛选后,选出2个强阳性
克隆, 2个克隆插入物的长度约为0. 5kb左右.
2.2 cD NA核苷酸序列的特征两个阳性克隆以
双脱氧核苷酸末端终止法测序后发现一个克隆的长
度为366bp,命名为SEP1;另一个克隆的长度为
458bp,命名为SEP2.SEP1核苷酸序列的5'端未
见起始密码, 3'端未见终止密码,po ly(A)信号
(AA TAAA)和po ly(A)尾巴(图1,A);SEP2核苷
酸序列的5'端也未见起始密码, 3'端有终止密码和
po ly(A)信号,但未见po ly(A)尾巴, 3'末端的非编
码区长度为158bp(图1,B).分析其核苷酸序列发
现两个克隆都含有一个由123个核苷酸组成的重复
序列,只有一个碱基不同,即SEP1的第8个碱基为
胞嘧啶(编码的氨基酸为苏氨酸),而SEP2重复序
列的第8个氨基酸为鸟嘌呤(编码的氨基酸为丝氨
酸).SEP1重复序列的123个核苷酸编码的41个氨
基酸分子量为4 445,而SEP2重复序列的分子量为
4 431.两个序列编码的41个氨基酸的等电点为pH
3. 38,其中疏水性氨基酸占24. 39%(10 41),中性
氨基酸占41. 46%(17 41),亲水性氨基酸占
34. 15%(14 41),在重复序列的中部有一个糖基位
点(N2X2S T,X为任何一种氨基酸).此重复序列在
SEP1克隆重复3次,但第三次重复时只有36个氨
基酸,其后有3个非重复氨基酸;在SEP2克隆重复
2次,第二个重复序列后终止密码前还有4个非重
复性氨基酸(图1).
2.3 同源性分析两个克隆的重复序列与Gen2
B ank中登录的序列比较,其重复序列部分与猬迭宫
SEP1
GA T TCCAA GA CCT GCA TA GCCT GCA CT GA GGAA GA T GA CAA CT GT TCCGA CT TA TCCA CT 60
D S K T C I A C T E E D DN C S D L S T
T GCGAA GA CA GCT GTCAA GGA GAA CCT GCCA GCCCCGAA CCA GAA CTCT TCAAA T GT GA C120
C E D S C Q G E P A S P E P E L F K C D
CAA GA T TCCAA GA CCT GCA TA GCCT GCA CT GA GGAA GA T GA CAA CT GT TCCGA CT TA TCC180
Q D S K T C I A C T E E DD N C S D L S
A CT T GCGAA GA CA GCT GCCAA GGA GAA CCT GCCA GCCCCGAA CCA GAA CTCT TCAAA T GT240
T C E D S C Q G E P A S P E P E L F K C
GA CCAA GA T TCCAA GA CCT GCA TA GCCT GCA CT GA GGAA GA T GA CAA CT GT TCCGA CT TA300
D Q D S K T C I A C T E E D D N C S D L
TCCA CT T GCGAA GA CA GCT GCCAA GGA GAA CCT GCCA GCCCCGAA CCA GAA CTCT TCA CA360
S T C E D S C Q G E P A S P E P E L F T
T T T GAA366
F E
SEP2
GCCA GCCCCGAA CCA GAA CTCT TCAAA T GT GA CCAA GA T TCCAA GA GCT GCA TA GCCT GC 60
A S P E P E L F K C D Q D S K S C I A C
A CT GA GGAA GA T GA CAA CT GT TCCGA CT TA TCCA CT T GCGAA GA CA GCT GCCAA GGA GAA120
T E E D D N C S D L S T C E D S C Q G E
CCT GCCA GCCCCGAA CCA GAA CTCT TCAAA T GT GA CCAA GA T TCCAA GA GCT GCA TA GCC180
P A S P E P E L F K C D Q D S K S C I A
T GCA CT GA GGAA GA T GA CAA CT GT TCCGA CT TA TCCA CT T GCGAA GA CA GCT GTCAA GGA240
C T E E D D N C S D L S T C E D S C Q G
GAA CCT GCCA GCCCCGAA CCA GAA CTCT TCAAA T GT GA CCAA GA CCCCAAA CA GT TA TAA300
E P A S P E P E L F K C D Q D P K Q L 3
A GT T T GA CGA CTCA T T TA TCA CCTCTAA CA TCAAA T T T TAA CA CTCA CTA CTCGCGT TA T360
TAA CT TCCTAA CCAA CT T GA TA CTA GA TCCAAA CT T T TCGGTCTA TA GCCCA TA TA CTAA420
CCTCA TCCA TA TA GCA T GA T GCCAAA GGCAATTAAAA C458
图1 猬迭宫绦虫幼虫cD NA的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列
F igure1 cD NAsequenceanditsdeducedam inoac idsequenceof
plerocerco idofSp irom e t rae r ina ce ieu rop a e i
N o te:T heam inoacid sa reind ica tedunde rthenucleo t idesequence.
N ucleo t ide sa renum be redf romthef irstnucleo t ideoftheclone.T he
f istth reeam inoacid sofrep ea t ingun it sa reunde rlined,p u ta t iveN2
linkedg lyco sy la t ionsequencedoub leunde rlined,theam inoacid sof
non2rep ea t ingsequenceda rkened,po ly(A)signa lita licizedand
unde rlined.3,stopcodon.
592 疾病控制杂志2001年12月第5卷第4期
绦虫一种含重复单位的细胞浆抗原基因(登录号为
U50190. 1)有很高的同源性(98%).与我们以前报
道裂头蚴的另外两个含123个核苷酸重复序列的基
因 8, 9 比较,同源性为33%(图2);而氨基酸序列完
全不同.
本研究 1:2TC2222C2A2A GA2222CCT GCA2TA GCC222T GCA222CT GA G2222GAA222GA T GA 35
文献9 1:2G.22GG.A.2. . .GGCT. .C.2.22.2. .A GAA. . .G2G.2.2.CT TCA. .T GC. . . .248
文献8 1:C. .T T GG2A.TCT T GG2T2.2A. .T.T.22A2A2.2.GT T. . .2.2T TC2222G2.22.241
3 3 3 3 33 333 33
本研究 36:CA2A CT GT TCC22GA2C22T2TA TCCA CT T GCGA2A GA C22A2GCT2GTCAA22GGA2GA80
文献9 49: . .G.222. . . .AA. .C.T G.G. .2. .2.2. . .2.CT. . .2G.T.A.2.A. . .2222.T.294
文献8 42:22G2. . .22G.2A.2222G.2.C.2.2. . . .2.2C. .2.T G2TCT.C.2. . .GT. . .T2.82
33 33 3333 33 33333 3
本研究 81:A CCT GCCA GCCCCG2A22222A2CCA GAA C2T2CT TCA222AA T GT GA CCAA G2A T123
文献9 95:222. .2.2.2222.2.C22T T.T. .2.22.2.22.G.2222C.G.A. . . .22222.123
文献8 83: .222.T.2.2222.A.CA GT T GT2.22.T.T.C. .2. .GT GC.2.2.2.T.T.C.G123
333 33 3 33 33 3333
图2 猥迭宫绦虫幼虫三种重复序列的比较
F igure2 Com par isonofthree123bprepea t ingsequencesof
plerocerco idofSp irom e t rae r ina ce ieu rop a e i
N o te:T hea lignm en tw a sm adeu singtheM axP rog ramof
GEN ET YXSof tw a re.U pp e rsequencew a srepo rtedhe reandlow e r
tw osequence srepo rtedbyL IU 8, 9 .T henucleo t ide scon se rved
w e rem a rkedw ithana ste risk(3)andgap s(2)w e rein t roducedto
m ax im izea lignm en t.
2.4 Northern印迹杂交分析以SEP1克隆做探
针,与裂头蚴和成虫的po ly(A)+RNA进行
N o rthern杂交.结果显示,裂头蚴在1. 5kb到4kb
处有多个很强的杂交带;而成虫没有杂交带(图3).
图3 Northernblot杂交结果
F igure3 TheresultofNorthernblot
L ine1,p le roce rco id;line2,adu ltw o rm.F igu re s(Kb)onthelef t
ind ica tethepo sit ion sofm a rke rs
3 讨论
本文报道了从猬迭宫绦虫的幼虫——裂头蚴
cDNA文库中用鼠抗裂头蚴多克隆抗体筛选出的两
个阳性克隆.此克隆与以前报道的从裂头蚴cDNA
文库中筛选的另外两个编码含有重复单位的多肽抗
原相似,也含有一个由123个核苷酸组成的重复序
列,但在编码的41个氨基酸中疏水性氨基酸的含量
(24. 39%)比以前克隆的两个基因少 8, 9 ,另一个特
点是本次克隆的基因片段的氨基酸序列中含有一个
糖基位点,以前克隆的两个基因未见糖基位点,说明
本次克隆的两个基因编码的抗原多肽为糖蛋白.克
隆的两个基因的重复序列编码的氨基酸序列等电点
为pH3. 38,低于以前的两个克隆pH5. 37 8 和pH
12. 34 9 .克隆的两个基因均是相应基因的部分片
段,因为两个克隆的5'端均未见起始密码,其中一
个克隆(SEP1)的3'端未见终止密码.同源性分析
表明,本次两个克隆的核苷酸重复序列与GenB ank
登录的一种猬迭宫绦虫含重复单位的细胞浆抗原多
肽的基因(登录号为U50190. 1)有很高的同源性
(98%),与以前的两个克隆的重复序列间只有33%
的同源性,但氨基酸序列间没有同源性.
裂头蚴在宿主体内移行或停留时,这些含重复
序列的多肽可能作为逃避抗原,使裂头蚴在体内逃
避免疫系统的杀伤.因为裂头蚴在体内停留或移行
时转录出多种含重复序列的m RNA,N o rthern杂交
实验证明,用SEP1作探针与裂头蚴和成虫的RNA
杂交后,裂头蚴从1. 5kb到4kb间有多个很强的
杂交带,而成虫没有杂交带,说明裂头蚴体内有丰富
的分子量大小不同的含重复单位的抗原性多肽,而
且这些抗原性多肽的表达有阶段特异性.已证明寄
生虫带有重复结构的蛋白质有很强的抗原性,机体
内主要的抗体反应都是针对重复序列决定簇的 12 ,
这些重复序列决定簇可竞争机体的保护性免疫反
应,从而使寄生虫逃避免疫系统的杀伤.研究发现重
复序列可能在蛋白质的演变中起一定的作用,蛋白
质迅速地发生演变可能与寄生虫逃避机体的保护性
免疫反应有关 13 .这些重复序列编码的抗原性多肽
在裂头蚴中的位置,有待于进一步研究.
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霍乱弧菌N haA基因的扩增,克隆和初步鉴定
张世英1,洪帮兴1,司徒潮满1,江丽芳2,郭辉玉2
【摘要】目的体外扩增,克隆霍乱弧菌O1群和O139群1 149bp的N haA基因片段.方法采
用PCR方法扩增N haA基因,经限制性内切酶BamHI和EcoRI酶切后用低熔点琼脂糖法回收纯
化,插入p cDNA3载体的多克隆位点,构建重组体,转化大肠杆菌,并对克隆基因进行酶切鉴定.
结果分别从霍乱弧菌O1群和O139群扩增出1 149bp的N haA基因片段,所构建的重组体经酶
切分析和预期结果一致.结论成功扩增并克隆我国散发霍乱O1群和O139群N haA基因,为研
究霍乱流行规律和基因疫苗提供了重要的实验依据.
【关键词】弧菌,霍乱遗传学;聚合酶链反应;克隆,分子
【中图分类号】R372 【文献标识码】A 【文章编号】100826013(2001)0420297203
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【Abstract】 O bject ive Toam p lifyandclo netheN haAgenef ragm en tinVibriocholeraeO1and
O139.M ethods T heN haAgenef ragm en tw a sam p lif iedbyPCR.A f te rd ige st io nw ithre st r ict io n
enzym e sBamHI EcoRIandp u r if ica t io n,theN haAgenef ragm en tw a sliga tedw ithp la sm id
p cDNA3a tpo ly linke r.T herecom b inan tp la sm idp cDNA32N haAw a st ran sfo rm edin to
E.coliDH5a.Po st iveclo ne sw e reiden t if iedbyd ige st io nw ithre st r ict io nenzym e s.Results T he
N haAgenef ragm en to fVibriocholeraeO1andO139w a sam p lif ied,clo nedandiden t if ied.
Conclus ion s Succe ssfu lam p lify ingandclo n ingN haAgeneo fVibriocholeraeO1andO139w o u ld
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【作者单位】1深圳市福田区卫生防疫站,广东深圳 518033 2中山医科大学微生物学教研室,广东广州 510089
【作者简介】张世英(1957-),男,安徽怀宁人,副主任医师.主要研究方向:传染病流行病学研究.
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(收稿日期 2001204210)
(修回日期 2001206210) 792 疾病控制杂志2001年12月第5卷第4期
·上一篇：liuxj002t20067139541804联赛
·下一篇：2006年普通高等学校招生全国统一考试(辽宁卷)

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