Red重组技术研究进展*

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Red重组技术研究进展*
中国生物工程杂志China Biotechnology, 2006, 26(1):81～86
张全**高会杰佟明友
(中国石油化工股份有限公司抚顺石油化工研究院抚顺113001)
摘要主要从Red系统组成元件,作用机理,重组策略以及先进性和发展前景四个方面综述了利用Red 重组系统敲除或替换细菌染色体目的基因的方法.首先简要介绍了传统的细菌染色体重组技术,指出了其中的缺陷.然后提出了Red重组技术的定义:利用噬菌体Red系统介导来实现外源线性DNA片断与细菌染色体的靶基因进行同源重组的方法,外源线性DNA通常是PCR产物,寡核苷酸片断等,在它们的两翼各含有与染色体靶基因两翼同源的序列40~60bp.这种Red重组技术省去了体外DNA酶切和连接等步骤,使细菌染色体靶基因的敲除与替换操作相对简单,逐渐成为基因功能探索以及新菌株构建的有力手段.
关键词Red重组系统细菌靶基因基因敲除
中图分类号Q813.4
收稿日期:20050426修回日期:20050929
*中国石油股份有限公司资助项目(104003)
** 电子信箱:zhangquan@fripp.com.cn日益成熟的微生物分子克隆技术为目的基因的研究提供了有效手段.例如目的基因的失活是目前研究基因的热点领域,最常用的方法是等位替换.在细菌中这种等位替换方法通常需要闭合环状的克隆载体介导才能实现[1~3].而在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和白色念珠菌(Candida albicans)中外源线性DNA片段可直接与染色体中的靶基因进行同源重组[4~6].大多数细菌因为核酸内切酶的存在而不能如S.cerevisiae等一样转化线性DNA[7].敲除细菌基因的传统方法是利用RecA重组系统.RecA重组系统是大肠杆菌内源性的同源重组体系,它由RecA和RecBCD组成.RecA蛋白促进各类DNA分子间的同源联会和配对.RecBCD分子量较大,是由RecB,RecC和RecD组成的复合体,具有ATP依赖的外切酶Ⅴ和解旋酶活性,它能与双链切口结合解开DNA链,并在Chi位点形成单链,然后由RecA蛋白促进同源重组.这种方法需要较长的靶基因同源序列,还需构建具有靶位点的质粒.噬菌体Red重组系统可以催化同源侧翼序列短的线性DNA片断与细菌染色体的靶基因进行同源重组.这种利用噬菌体Red系统介导来实现外源线性DNA片断与细菌染色体靶基因进行同源重组的方法即为Red重组技术,外源线性DNA通常是PCR产物,寡核苷酸片断等,在它们的两翼各含有与染色体靶基因两翼同源的序列40~60bp.这种Red重组技术省去了体外DNA酶切,连接等步骤,使细菌染色体靶基因的敲除与替换操作相对简单,逐渐成为基因功能探索以及新菌株构建的有力手段[8,9].下文将论述Red重组系统的结构,作用机理及其在细菌染色体基因敲除中的应用.
1Red重组系统的结构λ噬菌体基因Red区段编码了一个能够启动细菌染色体与外源DNA发生同源重组的系统.Red重组技术就是利用整合到细菌染色体或质粒中的Red系统编码的Red重组酶来实现外源PCR片段与基因组中靶基因的同源重组.λRed区段包括3个基因:bet(akaβ),exo和gam(akar)[8,10~13].Exo是5′→3′外切酶,能降解线性DNA的5′末端.晶体学研究发现,Exo核酸外切酶三个亚基组成环形聚合体,具有一个漏斗型的中心通道.bet基因编码的β蛋白是一个单链DNA(ssDNA)结合蛋白,它可以结合到由Exo产生的单链DNA 的3′端,从而启动互补DNA链的退火,引发DNA链的交换反应[8,11~13].β蛋白在溶液中的游离状态为环状物,当结合到 dsDNA时形成螺旋状纤维[14].β蛋白还可与Exo外切核酸酶形成复合体,调节核酸溶解和重组启动.gam基因的表达产物Gam蛋白与宿主的RecBCD复合体结合并抑制宿主外切核酸酶活性,阻止外源线性DNA片段被降解[8].
1.1Wanner重组系统的结构
2006, 26(1)张全 等: Red重组技术研究进展
中国生物工程杂志 China Biotechnology Vol.26 No.1 2006
Datsenko等[10]构建的辅助质粒如pKD20与pKD46含有包括gam基因在内的整套Red系统,见图1.利用pKD20与pKD46质粒完成的重组又称Wanner重组.pKD20有优化的核糖体结合位点,在阿拉伯糖启动子ParaB控制下高效表达γ,β和Exo酶.pKD20还是一个温度敏感性复制子,易从宿主中消除[10]. pKD46与pKD20相似,是在阿拉伯启动子PBAD控制下表达Red系统γ,β和Exo酶的温度敏感型低拷贝质粒.两种质粒都有λ噬菌体基因1 894bp (31 348–33 241) 和2 154 bp (31 088–33 241) 的碱基序列(GenBank编号:J02459).图1Red重组表达质粒pKD20与pKD46
Fig. 1Plasmids of pKD20 and pKD46 applied in Red recombination
2.2Court重组系统的结构
Red系统可以整合到染色体,Yu等[11]利用一个缺陷型λ原噬菌体实现了外源线性DNA在E.coli细胞中与体细胞DNA重组,称做Court重组 .这个缺陷型λ原噬菌体的Red表达系统是温度依赖型的,在 42℃培养7~20min即可启动重组.而且它不需宿主RecA,仅依赖于自身表达的Exo,Beta和Gam酶功能,见图2.图2中原噬菌体含有的λ基因从cl到int.图2E.coli染色体上的缺陷性原噬菌体
1)E.coli染色体基因; 2)λ原噬菌体基因;3)已删除的原噬菌体右边基因cro-attR-bioA;
PL与PR:左边和右边的启动子; attL与attR:λ基因与E.coli染色体基因连接位点
Fig.2The defective prophage in E.coli chromasome
13其他重组系统的结构
Murphy等[8]报道了在具有recBCD突变背景以及λ噬菌重组功能(Exo和Beta)的E.coli中高效重组含有与靶基因有较长同源序列的线性DNA的方法.此λ重组体系与酵母中的线性DNA重组功能相似,也是利用了细胞DNA双链断裂后的自我修复功能.
2Red 重组的作用机理E.coli与染色体同源重组有关的蛋白约有15～20种[15],但是仅RecA是重组必需的酶.RecA蛋白在细菌重组中起到联会与DNA链置换两个功能[16].解旋酶RecBCD则参与重组时发生的结合或普通性转导.RecBCD是一种复杂的核酸酶,当缺乏RecBCD蛋白时,诱导sbcB和sbcC或sbcD基因表达其它核酸酶,也能发生有效重组,这种重组依赖于RecG,RecQ和RuvAB等解旋酶[15].解旋酶PriA也在许多野生型细菌的重组中起重要作用[17].重组蛋白RuvC是结合专一性内切核酸酶,有Hollida连接体溶解酶的属性[18].
被λ噬菌体感染的E.coli会表达一种Red重组系统,该系统能够启动高效的双链断裂修复和瞬间重组.如果没有感染λ噬菌体的E.coli细胞表达λ重组蛋白,这种Red诱导的"高效重组"能力会持续存在[19].图3是Red介导的重组机理[20].重组过程中,λ噬菌体的Gam蛋白使RecBCD编码的酶失活,从外源线性DNA的双链末端启动Red介导的重组.然后λ外切核酸酶(Exo)结合到外源线性DNA片断的双链末端,连续降解5′末端链,留下3′单链尾巴.接着RecA和RecB蛋白引导3′单链尾巴与细胞染色体的靶基因同源序列配对,置换靶基因.当宿主细胞缺失RecBCD时,λRed重组只需起双链修复和重组作用的Exo和Redβ蛋白参与即可.重组的其它步骤由宿主蛋白来完成.
Poteete等[20]提出了一个不依赖解旋酶RuvC和RecG的Red重组机理,见图4.该重组过程的前几个步骤与图3同,但是由于宿主缺失RecG,所以在随后的图3Red介导的线性DNA与细菌染色体基因重组机理
Fig. 3Possible mechanism of Redmediated recombination involving strand invasion
图4Red介导不依赖RuvC和RecG的线性DNA与细菌染色体基因重组机理
Fig. 4Possible mechanism of recombinant formation via the Red pathway independent of RuvC and RecG
过程中DNA链的支点发生了移位,导致在标记B位置形成了异源双链.然后宿主中存在的自发性错配修复系统把异源双链修复为同源双链.整个过程绕开了Holliday连接体的内切酶溶解过程.接着内切核酸酶从被置换链的右侧某位点断裂并修剪了被置换链.但是如果异源序列插入到了置换链末端和标记B的位置,则通向如图4a所示的重组路径将受到阻碍,因此更依赖于RuvC和RucG,见图4b.
3Red重组策略本文主要介绍两个2000年开发并应用的Court重组和Wanner重组方案.它们都利用一个具有非常短同源序列(30~50bp)的PCR产物启动染色体靶基因失活.这一类方案中发生的DNA交换通常叫做"Red-交换".
31Court重组策略
Court重组方案利用整合在E.coli染色体上的缺陷性原噬菌体在cI857(Ts)抑制子控制下从λPL表达bet,gam和exo基因,见图2.利用Court重组,重组率可以达到0.1%以上.Court重组策略分为三步:第一步,合成2个寡核苷酸片段作为PCR引物.寡核苷酸的5′端有30～50bp与靶基因末端同源,3′端有20bp与替换基因的末端同源.利用PCR扩增获得侧翼与靶基因有30~50bp同源序列的线性DNA片段;第二步,诱导宿主细胞表达Exo,Bata和Gam蛋白并制备成感受态细胞,然后与PCR扩增获得的线性DNA片段混和电转化;第三步,线性PCR产物与宿主靶基因的同源序列发生替换,完成重组.
32Wanner重组策略
Wanner重组方案与Court方案相似,如图5.第一步,合成与靶基因(基因B)有36bp同源(H1和H2)的引物,PCR扩增获得抗生素抗性(如kanr)基因作为替换序列片断;第二步,把含有pKD20或pKD46的细胞制备成感受态细胞,电转化抗生素抗性基因片段;第三步,抗性基因与靶基因同源重组.抗生素抗性会对环境造成不确定性影响,因此可以选择在第四步利用一个表达FLP重组酶的帮助质粒,如pCP20去除抗生素抗性基因.因为Red和FLP帮助质粒都是温度敏感型复制子,所以当细胞在37℃生长时就能轻易被去除.
4Red重组技术的先进性及应用前景传统的重组技术由于宿主细胞的RecBCD具有核酸外切酶Ⅴ的活性,线性DNA分子进入到宿主细胞中即被降解,需要一个把线性DNA片段体外重组到环形图5Wanner重组方案
Fig. 5Wanner recombination strategy
(a): Step1. PCR amplification of FRT-flanked resistance gene; (b): Step2. Transformation of strain expressing λRed recombinase;
(c): Step3. Selection of antibiotic-resistant transformants; (d): Step4. Elimination of resistance cassette using a FLP expression plasmid
H1, H2: The homology extensions or regions, P1, P2: Priming sites
质粒的步骤,还需将靶基因两翼至少200bp的DNA序列克隆到打靶质粒,再通过结合转移,依靠RecA同源重组系统才能将打靶质粒整合于细菌染色体上,然后整合于染色体上的打靶质粒再发生第二次同源重组.重组的结果有两种可能:一是把目的基因敲除,通过抗药性基因的筛选,就可以筛选得到二次重组子(即基因敲除的缺失突变体);另一种情况是回复为原始状态.而Red重组技术需要的同源臂只有36~50bp(此长度的碱基序列容易合成),直接利用线性DNA即可实现同源重组,不需要克隆到打靶质粒,只需一次同源重组即可实现基因敲除,因此大大地简化了操作步骤,得到了广泛应用.
Red重组系统在E.coli中的应用已经非常成熟.如,Datsenko等[10]在Red系统帮助下利用含有与靶基因有同源侧翼序列的PCR产物敲除了E.coli K12菌株中的arcB,cyaA,ompRenvZ, phnR,pstB,pstCA,pstS,pstSABphoU,recA torSTRCAD等基因.
Red系统不仅可以用于E.coli靶基因的敲除,还能应用于敲除其它细菌及病毒的目的基因.如Muyrers等[21]在沙门氏菌(Salmonella),Murohy在肠致病性大肠杆菌(eteropathogenic E.coli)和肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic E.coli),王恒梁等[22]在痢疾杆菌(Shigella flexneri),以及侯松旺等[23]对棉铃虫单粒包埋型核多角体病毒(HaSNPV)都利用Red系统进行了靶基因的敲除与置换.
随着研究的深入,相信Red系统的应用范围会越来越广泛,为基因功能的改良以及后基因组时代基因功能的研究做出不可估量的贡献.
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Advances in Red Recombination Applied in Knockout of
Bacteria Chromosomal Gene
ZHANG QuanGAO HuijieTONG Mingyou
(Fushun Research Institute of Petroleum and Petrochemicals, SinopecFushun113001, China)
AbstractTraditional recombination technology of bacteria chromosome and its limitation were introduced. The definition of Red recombination technology is put forward: a method of homologous recombination between foreign linear DNA and the target gene in chromosomes mediated by λ phage Red system. The linear DNA referred here is general PCR product or oligonucleotide, which has a 36~50bp homologous sequence with the target gene in chromosome at both flanking. Red recombination technology leaves out the in vitro DNA restriction enzyme digestion and link process, which makes the knockout and alternation of target gene in bacteria chromosome relatively easier, and becomes an effective method to exploring genes and constructing new strains gradually. The gene inactivation and alternation method aiming at bacteria chromosome applied to Red recombination system was summarized by the structure element, action mechanism, and strategy of recombination, advantage and developing prospect. The Red system includes three genes: bet (akaβ), exo and gam (aka γ). Exo is a 5′→3′ exonuclease, which degrades the 5′ ends of linear DNA molecules. Bet is a singlestranded DNA binding protein that binds to the single stranded 3′ ends generated by Exo and promotes annealing to complementary DNA. Gam binds to the host RecBCD complex and inhibits its exonuclease activity. Red recombination system may be constructed in such plasmids as pKD20 and pKD46 or in chromosome of bacteria. Most bacteria are not readily transformable with linear DNA because of the presence of intracellular exonucleases that degrade linear DNA. But when bacteria cells are transformed with pKD20 or pKD46 plasmid, or integrated with a detective λ prophage, Red recombination enzymes may be expressed in host cells, which make linear DNA with 36~50bp extensions that are homologous to both flanking of target genes transform E.coli readily and knockout or alternate target gene. The Red recombination method is not only useful in chromosomal gene inactivation in E.coli, but also in other bacteria or virus, such as Salmonella, Shigella flexneri and virus HaSNPV. With the proceeding research, Red system will be applied for more and more purposes, and contribute a lot for gene improvement and gene function investigation in the coming Postgenome Era.
Key wordsRed recombination systemBateriaTarget geneGene knockout

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