高雄医学大学附设中和纪念医院

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内容摘要：

高雄医学大学附设中和纪念医院高雄医学大学附设中和纪念医院 临床医学研究部
流式细胞仪细胞分选委托注意事项
事前沟通
应知道细胞的大小与型态,以利仪器nozzle的选择
需准备多少细胞
如果想要sorting出的细胞占原细胞族群10%,又希望最后得到1 x 105细胞,则理论上要准备1 x 106细胞
但是操作过程与过mesh都会loss 约30-50%,则至少要准备二倍数量的原始细胞 (2 x 106)
时数计算
生物安全性问题
由於在sorting过程中,检体会经过液滴震荡方式产生微小液滴,所以医研部不接受会传播人类病原菌的生物有害样本,也不接受含放射性生物检体.任何其他有疑虑的有害检体,必须事前说明与沟通.
检体制备注意事项
力求检体为单一细胞状态(single cell sus pension),并且无细胞团块与碎片
会接触到细胞的所有试剂溶液,皆用0.2mm filter过滤
所有检体上机前必须用40 mm mesh过滤(例:Falcon Cat. No. 352340 或 Cat. No. 352235)
如果细胞容易聚集成团(aggregate),应考虑上机前再进行mesh过滤,因为时间一长,细胞可能再度聚集
死细胞在sorting时如果无法圈选去除,会影响细胞回收率与纯度,在不影响实验下,建议加入PI(FL2 or FL3)或是7-AAD(FL3)
适当的sample buffer
培养细胞的培养基并不适合用於sorting
Phenol red 与fetal bovine serum (FBS)会干扰sorting过程
建议的基础配方
For lymphocytes(依照细胞与实验性质择一使用)
1 mM EDTA, 25mM Hepes (pH7.0) and 0.5% - 2% BSA in 1x PBS (without Ca2+ and Mg2+)
1x HBSS (without phenol red) with 1% BSA
0.5% - 2% BSA in PBS(without Ca2+ and Mg2+)
For adherent cells(依照细胞与实验性质择一使用)
5 mM EDTA, 25mM Hepes (pH7.0) and 0.5% - 2% BSA in 1x PBS (without Ca2+ and Mg2+)
0.5-2% BSA in PBS(without Ca2+ and Mg2+)
当检体含有高比例dead cell时
5mM MgCl2, 1 mM EDTA, 25mM Hepes (pH7.0), 25-50 mg/ml DNAase I and 0.5% - 2% BSA in 1x PBS (without Ca2+ and Mg2+)
建议询问有经验者(使用相同细胞进行过sorting者)的sample buffer配方,以减少试误时间
如果sorting后细胞还需培养,建议样品收集管内放0.5-1 ml的培养基或是FBS,以增加细胞存活率
简便的检体处理
检体处理以步骤越简单,处理时间越短越好
处理好的检体越快上机越好
Sorting后的细胞越快继续往下做实验越好
如果要sorting多个样本,建议一次处理一个,估计可能的上机时间后,再处理第二个样品
理想样品浓度
For lymphocytes, thymocytes and splenocytes – 0.5-1 x 107 / ml
For adherent cell line –1-3 x 106 / ml
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